白癜风的早期症状都有哪些 http://pf.39.net/xwdt/151104/4721404.html角膜缘干细胞（Limbalstemcell，LSC）是位于角膜和球结膜交界处的组织特异性干细胞，通过不断更新角膜上皮保护眼表的健康。创伤、烧伤和炎症性疾病可破坏眼表的稳态，导致角膜混浊、血管化、瘢痕形成和视力受损。基于LSC的治疗方法已经被用于眼表疾病的治疗当中，这种治疗方法向临床转化的关键在于细胞能否成功地被输送到特定区域，以及在指定区域的存活和保留。通过使用合适的载体为LSC提供锚定位点和结构支撑，可以解决这一问题。因此，来自坦佩雷大学的HeliSkottman教授团队和来自巴塞罗那材料研究所的AnnaLaromaine与AnnaRoig教授团队，对细菌纳米纤维素（Bacterialnanocellulose，BNC）进行改性，探究了BNC作为LSC载体的应用。首先，为了增强细胞在BNC膜上的附着，研究者对BNC膜进行等离子体活化，然后将BNC膜在由重组人层粘连蛋白（LN-）、IV型胶原（ColIV）和磷酸盐缓冲溶液组成的“细胞外基质（ECM）缓冲液”中培养过夜，得到等离子体+ECM涂层的BNC膜。同时，研究者还制备了直接用ECM缓冲液培养以及未经任何处理的BNC膜作为对照。对BNC膜进行不同处理的过程如图1A所示。研究者使用扫描电镜探究了不同的处理方法对BNC微结构的影响，发现等离子体处理后BNC的纳米纤维形貌发生了变化（如图1F-H），而各组BNC膜的背面均未发生明显变化（如图1I）。随后研究者对各组BNC膜上的ColIV进行免疫荧光染色，以研究涂层的分布。直接使用ECM溶液孵育的BNC膜，涂层不均匀、不完整（如图1C），并在BNC膜的孔隙结构中积聚了ColIV。经等离子体处理后的BNC膜，ColIV覆盖得更均匀、更丰富（如图1D）。通过比较两种处理方法后的荧光强度值（如图1E），研究者再次证实了这一结论。研究中，各组BNC膜的形态都是柔软且半透明的，显示出与穹顶状表面良好的顺应性（如图2A）。此外，表面处理对BNC膜透光率的影响几乎可以忽略不计（如图2B）。所有所研究的BNC膜在长波长都表现出较高的光透过率，而在较小的波长下表现出逐渐下降的趋势。接着，研究者采用体外器官培养模型评估BNC膜作为支架移植到眼表的适用性。研究者对离体猪角膜造成上皮损伤，随后植入BNC膜，培养14天后，按图3A所示范围进行切片，并进行组织学分析。在样品制备过程中，BNC膜与角膜的圆顶形状具有极好的一致性，可以切割成所需的大小，并且很容易在体外缝合到眼表上（如图3B）。HE染色显示，一些受试眼的BNC膜与角膜表面紧密接触。值得注意的是，在BNC膜下有连续的角膜上皮再生（如图3C-D）。随后，研究者评估和比较了各组BNC膜促进人胚胎干细胞来源的角膜缘干细胞（hESC-LSC）附着和存活的能力。培养24h后，细胞形态有明显差异。将hESC-LSC培养在等离子体+ECM涂层的BNC膜上，显示出均匀的分布和上皮细胞外观（如图4D）。相反，种植在普通的BNC膜上（如图4A）、只接受等离子体活化（如图4B）或仅接受ECM涂层（如图4C）的BNC膜上的hESC-LSC呈圆形，表明这些基质不适合细胞的生长。在接种后的第4天，活/死染色证明在等离子体+ECM涂层的BNC膜上有高度活性的细胞出现（如图4H）。hESC-LSC从仅有等离子体激活和普通的BNC膜上脱落（如图4E，F），而在仅有ECM涂层的BNC膜上有hESC-LSC的附着，但主要是死细胞，不能扩散和染色（如图4G）。由于等离子体+ECM涂层的BNC膜具有促进细胞贴壁和增殖的能力，因此研究者进一步研究了hESC-LSC在这种BNC膜上的自我更新能力。细胞数量在第1天到第3天之间可以观察到增加，而从第3天到第7天，细胞密度稳定，细胞体积增加（图5A）。hESC-LSC在三个研究时间点显示出鹅卵石的形态，并倾向于在BNC膜上形成上皮单分子层，如共聚焦显微镜所示（图5B）。研究者用PrestoBlue实验定量分析代谢活性（图5D），在培养的早期阶段检测到荧光信号的增加，但在晚期荧光强度则保持不变。为了进一步证实这些结果，研究者进行了增殖标记物Ki67的免疫荧光染色（图5C）。在hESC-LSC培养的第1天、第3天和第7天检测到Ki67的表达，表明存在一个自我更新的细胞群体，且在培养第1天时，Ki67阳性细胞的百分率高于第7天。最后，研究者研究了在BNC膜上培养的hESC-LSC是保留干细胞表型，还是开始向角膜上皮细胞分化。为标记LSC，研究者同时使用p63α和p40抗体检测细胞核中p63的异构体——ΔNp63α的存在。并且，为了进一步验证细胞表型，研究者选择CK14和CK15作为干性指标，CK12作为分化的角膜细胞标志物。图6A的免疫荧光显示，在BNC膜上培养的hESC-LSC在第3天和第7天高表达ΔNp63α且低表达CK12，这与在ECM涂层培养皿上培养的标记表达相同（如图6A中的Ct）。CK14和CK15的表现则不同，尽管干性标记CK14和CK15都呈现阳性，但在第4天时的免疫荧光的强度均不如ΔNp63α均匀，并且到第7天时CK14表达消失（如图6B）。综上所述，该研究发现，BNC膜可以保留hESC-LSC的干细胞表型，并支持新的子代细胞形成，同时提供合格的力学支持。此外，BNC膜在hESC-LSC分化和培养过程中能够整合细胞与生物材料，使其有望在眼表治疗中得到临床应用。同时值得注意的是，使用等离子体激活，随后使用ECM涂层覆盖BNC膜的功能化方法简便、快捷，可用于其他治疗性细胞的培养，扩大了BNC膜作为细胞载体的可能性。本研究由来自坦佩雷大学的HeliSkottman教授团队和来自巴塞罗那材料研究所的AnnaLaromaine和AnnaRoig教授团队合作完成，并于年2月发表于Small。论文信息：IreneAnton-Sales,LauraKoivusalo,HeliSkottman*,AnnaLaromaine*,AnnaRoig*.LimbalStemCellsonBacterialNanocelluloseCarriersforOcularSurfaceRegeneration.Small,17(10):e.
供稿：朱壮
审校：孙亨
编辑：陈起新
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