角膜位于眼睛的最外表面，在视觉系统中起着重要作用,全世界每年有多万人患有各种角膜疾病,穿透性角膜移植术由于短期成功率高，是改善严重角膜疾病所致视力障碍最常用的移植手术,由于供体角膜的短缺而且可用性低,不能满足需求，开发角膜移植的替代治疗方案是必要和紧迫的，其中包括有基于细胞的治疗和生物工程构建。
各种生物工程方法来制造基于天然材料或天然和合成材料的组合的人工角膜，其机械性能和光学透射率类似于天然角膜，并且可以很好地支持角膜细胞的粘附、迁移、增殖和分化，但是它们不能模拟天然复杂角膜组织的自然微环境，并且角膜组织中最复杂的部分是基质，角膜基质占整个角膜的90%，由正交排列的胶原纳米纤维薄片组成，对光的透明性归因于胶原纤维独特的紧密堆积和均匀的直径，模拟正交排列的纤维结构和维持角膜细胞表型是必要的和关键的。
由于角膜的结构复杂和角膜细胞-成纤维细胞转化，角膜基质的再生一直是一个挑战。在本研究中，我们制备了网格状聚ε-己内酯-聚乙二醇微纤维支架，并在支架中注入甲基丙烯酸明胶水凝胶，得到三维纤维增强水凝胶结构；调节纤维间距以制造最佳构造模拟具有与天然角膜最相似性质的基质结构。检测拓扑结构(三维纤维增加水凝胶、三维凝胶和二维培养皿)和化学因子(血清、抗坏血酸、胰岛素和β-FGF)以研究它们对角膜缘基质干细胞向角膜细胞或成纤维细胞分化以及表型维持、体外和体内组织再生的影响。结果表明，纤维增强水凝胶结构和无血清介质协同作用下，为角膜细胞表型的维持和受损角膜基质的再生提供了最佳环境。
近期发表在NatureCommunications杂志上题为“FiberreinforcedGelMAhydrogeltoinducetheregenerationofcornealstroma”的文章，是来自于清华大学孙伟教授团队，设计了纤维增强水凝胶结构能够在体外和体内诱导受损角膜基质的再生。
首先，通过采用近场直写打印技术制备了亚微米纤维支架，其平均直径约为5um，纤维间距50um、um、00um、um、um、um，接种在网格支架上的骨髓间充质干细胞可粘附在纤维上，并沿正交排列的结构扩散。5%浓度的GelMa对细胞的培养具有高生存力和铺展程度,将凝胶溶液注入到具有50-um网格支架的模具中来制备纤维增强水凝胶结构，分别命名为50g、g、00g、g、g和g，发现g的结构具有高透光率。测量50g、g、00g、g、g和g构建体的拉伸和压缩强度、透光率和膨胀比，实验验证G的构建体具有与天然角膜组织最相似的性能。
图1纤维水凝胶表征的制作。a.一个定制的直接书写装置，一个直接书写的示意图，和一个从泰勒锥喷出的聚合物射流。b.获得的卷曲线(比例尺为μm)、网格(比例尺为μm，放大图像为μm)、直线和专门设计的图案(比例尺为10mm)的图像。c.在特定条件下，不同衬底移动速度下的稳定喷射沉积图像。比例尺为μm。d.不同放大倍数下纤维间距为50-μm的网格支架的扫描电镜图像。比例尺为50μm。e.接种在网格支架上的干细胞可诱导沿纤维方向生长，细胞用phalloidin(红色)和DAPI(蓝色)染色。标尺为μm。f.形成的凝胶的宏观和微观形态分别为5%、10%和15%。宏观图像的比例尺为10毫米，扫描电子显微镜图像的比例尺为80um。g.在5%凝胶基质水凝胶中的骨髓间充质干细胞的生存能力。活细胞呈现绿色，死细胞呈现红色。比例尺为μm。h.在5%明胶海绵水凝胶中的骨髓间充质干细胞的细胞骨架(红色)和DAPI(蓝色)染色。比例尺为μm。i-l.制作的μm间距网格纤维增强凝胶。i–k.中的比例尺为10mm，k中的放大图像为1mm，i为μm。
图纤维增强水凝胶结构的性质。a.在PBS中孵育1小时后，50G、G、00G、G、G和G构建体和无细胞角膜的平均应变-应力曲线。b.样品在a中断裂时的应变直方图。c.样品在PBS中孵育0、7、14和8天后的最大拉伸应力直方图d.50G、G、00G、G、G和G构建体、无细胞角膜和纯凝胶基质水凝胶的压缩模量直方图。e.50G、G、00G、G、G和G构建体和脱细胞角膜在PBS中孵育1小时(第0天)后的平均透射光谱。f.在纳米波长的PBS中浸泡0、7、14和8天后，构建50G、G、00G、G、G和G的透射率直方图。
接下来验证拓扑结构和化学效应对角膜细胞的影响，角膜缘基质干细胞(LSSCs)分别接种到D-TCP、3D-GelMa结构、g构建体上，并在SC（含血清）、SF（不含血清，含抗坏血酸、ITS-X、β-FGF）两种培养基上培养，培养7天后，通过免疫荧光染色研究波形蛋白(成纤维细胞特异性表达)和ALDH3A11(角膜细胞特异性表达)的表达，在SC培养基上，D-TCP、3D-GelMa结构角膜细胞转化成成纤维细胞，但在g结构无此现象。在SF培养基中，接种在所有构建体上的细胞表达ALDH3A1。为了进一步验证拓扑和化学效应，通过qPCR评估培养周后角膜细胞特异性，在g构建体中，即使存在血清,角膜细胞可以保持其表型。此外，g构建体和无血清培养基的协同作用可以为维持角膜细胞表型提供最合适的地形和化学环境。培养4周后，g构建体中的角膜基质组织细胞外基质（胶原VI的表达）不收缩。
图3拓扑结构和化学因素对角膜细胞的影响。a.培养7天后，在DTCPs、3DGelMA和G构建体上的干细胞培养基中的波形蛋白表达和细胞骨架染色。图像显示波形蛋白(绿色)、*笔环肽(红色)和细胞核(蓝色)的荧光染色。比例尺是um。b.培养7天后，在D-TCPs、3D-GelMA和G构建体上,其中在SF培养基中LSSCs的ALDH3A1表达和细胞骨架染色。图像显示ALDH3A1(绿色)、phalloidin(红色)和细胞核(蓝色)的荧光染色。比例尺是um。c–h.在D-TCPs、3D-GelMA和G构建体(n=3，生物独立样品)上培养的LSSCs中的角膜蛋白、ALDH3A1、AQP1和THY1的分别在SC培养基或SF培养基中表达，培养周后的通过qPCR定量；定量由β-肌动蛋白信号标准化。i.免疫荧光染色显示培养4周后接种于DTCPs或SF培养基中G构建体的骨髓间充质干细胞分泌的胶原蛋白VI(绿色)。细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺为μm。j.在SF培养基下培养4周后，细胞在g构建体(n=3，生物独立样品)上沿正交排列的纤维排列的程度。
对大鼠基质内角膜移植及其评价开展实验,将自体移植物、3D凝胶、含化学因子的3D凝胶、g纤维水凝胶和含化学因子的g纤维水凝胶移植入30只大鼠的角膜,术后1个月，组织学HE染色和胶原VI免疫荧光染色均显示有因子的移植物比无因子的相同移植物更能诱导基质再生。有纤维的移植物比无纤维的移植物更能诱导基质再生,术后3个月，因子和纤维对基质再生的影响与术后1个月相同。结果表明，g和化学因子的协同作用可以提供最合适的地形和化学环境来诱导角膜基质在体内的再生。
图4纤维水凝胶植入和基质基质合成和大鼠角膜体内再生。a.术后1个月和3个月自体移植物、含或不含化学因子的3d凝胶、含或不含化学因子的克纤维水凝胶。白色箭头表示移植物的位置。b.术后同一眼角膜的光学相干断层扫描图像。白色箭头表示移植物的位置。比例尺为μm。c.通过测量每组和每个时间点的角膜(n=3，生物独立样本)来测量中央角膜的厚度。数据按平均标准差计算。d.在第1个月和第3个月，移植角膜的冰冻切片用第六型胶原抗体(绿色)免疫染色。在所有图像中，细胞核与DAPI(蓝色)共染色，比例尺为μm。e.移植角膜在第1个月和第3个月的苏木精-伊红染色，比例尺为μm。
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